Aplikace mikroskopie atomárních sil při studiu modelových systémů a biologických vzorků 

Příprava vzorku:

1. do měřící cely vložte čerstvě sloupnutou slídu
2. na slídu kápněte 250 μl vychlazeného pufru s 2 mM CaCl₂, do této kapky přidejte 50μl vezikul připravených pomocí sonikace
3. inkubujte 20min
4. pomocí dvou pipet promyjte vzorek pufrem s 2 mM EDTA, promytí proveďte velmi opatrně dle instrukcí vedoucího cvičení
5. poté pufr a vzorek vezikul vložte do termobloku a inkubujte při 37ºC
6. v případě dostatku času opakujte postup přípravy vzorku s temperovanými chemikáliemi

Nastavení měření:

1. na skenovací hlavu připojte nástavec pro skenování v kapalině, vložte do něj hrot
2. otevřete program AverTV a Nova 1443, otevřete záložku Aiming a nalaďte maximální intenzitu laseru (laser by měl být umístěn v horní třetině cantileveru – kontrola pomocí kamery)
3. ponořte spodní část hranolu se sondou do kapaliny
4. zkontrolujte přítomnost vzduchových bublin pod cantileverm, vycentrujte odražený paprsek laseru na střed fotodiody
5. nastavte skenování v kontaktním módu
6. v settings zvolte calibrations a vyberte Load calibrations
7. zvolte skener, který budete při dané úloze používat a požadovaný druh prostředí (dry/liq)
8. vložte vzorek do skeneru a zvedněte stolek až téměř k rastrovací sondě, při manipulaci s měřící celou buďte opatrní, aby se kapalina nedostala do skeneru!
9. nastavte Set Point, hodnota Set Pointu by měla přibližně aktuální hodnota deflexe +1,2 pro dosažení kontaktu
10. proveďte přiblížení cantileveru ke vzorku pomocí tlačítka Landing v záložce Aproach
11. po dosažení kontaktu snižte hodnotu set pointu, hodnota set pointu by měla být jen      o málo vyšší než hodnota deflexe
12. v záložce Scan nastavte velikost skenované oblasti 10μm, skenovací rychlost 1Hz, jako mód skenování zvolte Lateral force, velikost skenu pak upravte dle potřeby

Pozorování a vyhodnocení měření:

1. pomocí funkce Arbitrary Cross Section porovnejte výšku pozorovaných domén v závislosti na přítlaku
2. pozorujte kvalitu obrázku v módu Lateral Force v závislosti na přítlaku
3. v případě provedení u druhé sady experimentů porovnejte velikost pozorovaných domén v závislosti na teplotě přípravy vzorku

Otázky a úkoly:

1. do úvodní části protokolu uveďte možnosti využití metody AFM ve studiu biologických objektů
2. vysvětlete pojem amfifilní molekula, dohledejte názvy a vzorce fosfolipidů se zkratkami DLPC a DMPC, zjistěte teploty jejich fázových přechodů (avantilipids.com)
3. diskutujte vliv velikosti přítlaku na kvalitu obrázků v módu Lateral Force a na výšku pozorovaných domén
4. do závěru shrňte svá pozorování, uveďte možnosti využití mikroskopie atomárních sil při studiu imobilizovaných fosfolipidových dvojvrstev